導讀

　　血友病是一種遺傳性疾病，患者可能因為輕微碰撞，就會流血不止，嚴重時將危及生命，其病因是缺少凝血因子。人凝血因子VIII就是一種重要的凝血因子，是一種由血管內皮細胞合成并分泌入血的蛋白質，缺乏將導致甲型血友病。目前血友病的治療以替代療法為主，就是常說的“缺啥補啥”，即向患者體內輸注缺少的凝血因子來幫助止血，可以說凝血因子是血友病患者的“救命藥”。

　　人凝血因子VIII產品可由人血漿中分離提取或經基因重組技術生產。我國臨床上主要使用的是人血漿來源產品，其成分較為復雜，除人凝血因子Ⅷ外，還可能含有多種血漿蛋白、肝素鈉、聚乙二醇 3350、聚山梨酯80、氨基酸、磷酸三丁酯等諸多成分。其中聚乙二醇和聚山梨酯80為生產中用到的試劑，前者用于分離純化，后者用于病毒滅活，需要監(jiān)控其在終產品中的殘留量。

　　人凝血因子VIII中聚合物雜質是怎么產生的呢？

　　人凝血因子VIII中主要有兩種聚合物雜質，分別是聚乙二醇3350（又名PEG3350）和聚山梨酯80（又名吐溫80）。

　　聚乙二醇3350是一種親水性聚合物，廣泛用于蛋白質、核酸等生物大分子的分離純化，也是人凝血因子VIII分離制備過程中的常用試劑。相關研究表明，聚乙二醇可能是一種半抗原，應進行質量控制。

　

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  聚乙二醇3350（PEG 3350）

  o親水性聚合物

  o用于分離制備

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  聚山梨酯80（Tween 80）

  o非離子型表面活性劑

  o用于病毒滅活和增溶

 

　　聚山梨酯80是一種非離子型表面活性劑及乳化劑，廣泛用作藥物輔料。人血漿來源的人凝血因子VIII產品具有潛在病毒風險，為保證其安全性，需要進行病毒滅活。常用的病毒滅活工藝為有機溶劑/去污劑(S/D)處理法，即采用有機溶劑磷酸三丁酯和表面活性劑聚山梨酯80結合進行病毒滅活。為保證產品安全性和有效性，應在滅活后去除滅活試劑，并對其殘留量進行檢測和監(jiān)控?！吨袊幍洌?020年版）》對聚山梨酯80的殘留量要求是不高于100 μg/mL。

　　人凝血因子VIII中聚合物雜質怎么測?

　　《中國藥典（2020年版）》第三部人凝血因子Ⅷ檢定項下，聚乙二醇和聚山梨酯80殘留量的測定，分別依照通則3202和通則3203，采用紫外分光光度計法進行測定。該方法選擇性低，容易受到共存物干擾。

　　另一種聚合物分析常用方法是尺寸排阻色譜法，由于聚山梨酯80、聚乙二醇3350、肝素鈉等聚合物分子量分布存在交疊，難以分離，影響定量準確性。

　　因此，開發(fā)一種選擇性好，準確度高的分析方法進行聚合物雜質的分析，很有必要。

　　- 島津解決方案 -

　　我們開發(fā)了一種液相色譜儀結合蒸發(fā)光散射檢測器ELSD-LT Ⅲ檢測人凝血因子Ⅷ中聚合物殘留的分析新方法。聚乙二醇3350和聚山梨酯80均無紫外吸收，使用ELSD-LT Ⅲ既可實現(xiàn)高靈敏度的定量測定，又可通過梯度洗脫改善分離，有效避免人凝血因子Ⅷ中復雜共存物的干擾。

　　分析儀器

島津Nexera LC-40液相色譜儀+蒸發(fā)光散射檢測器ELSD-LT Ⅲ

　　方法學結果

　　使用外標法繪制校準曲線，聚乙二醇3350和聚山梨酯80相關系數(shù)大于0.998，回讀值準確度在90.9~109.3%之間，線性良好；校準曲線低濃度六次連續(xù)進樣的峰面積RSD不大于3%，精密度良好；校準曲線低濃度下的加標回收率在93.2~103.6%之間，準確可靠。

圖1. 聚乙二醇3350色譜圖（左，50 mg/L）和校準曲線（右）

圖2. 聚山梨酯80色譜圖（左，10 mg/L）和校準曲線（右）

表1. 方法學結果

　　實際樣品分析

　　人凝血因子VIII復溶液高速離心后上機分析，樣品中未檢出聚乙二醇3350，檢出聚山梨酯80，含量為38.9 mg/L。

圖3 人凝血因子Ⅷ樣品色譜圖

　　

　　結語

　　血友病患者因為先天基因突變導致體內凝血因子不足，通常需要終身注射補充凝血因子?？紤]到臨床長期用藥的特點，凝血因子類產品的安全性尤為重要。聚乙二醇3350和聚山梨酯80是人凝血因子Ⅷ生產中的重要試劑，但都有潛在不安全性的特點。因此，準確測定人凝血因子Ⅷ產品中聚合物雜質殘留量，保證其在安全限度內，十分必要。液相色譜儀結合蒸發(fā)光散射檢測器ELSD-LT Ⅲ進行聚合物雜質殘留量測定，可有效避免人凝血因子Ⅷ產品中復雜共存物干擾，靈敏、準確、前處理簡單，讓血友病“救命藥”更安全，患者用藥更安心。